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    • 专利摘要:
    一種從杜莎藻製備高含量β-胡蘿蔔素奈米粉粒體之方法，主要是將杜莎藻粉經超音波四氫呋喃(THF)溶劑萃取，經3公分管柱純化後，再以超臨界二氧化碳抗溶四氫呋喃(THF)溶液獲得結晶沉澱。3公分內徑管柱層析純化方法，可得到固形物含36%純度的β-胡蘿蔔素且回收率為35.9%。再經超臨界二氧化碳抗溶結晶沉澱之後，β-胡蘿蔔素的純度可達728.5 mg/g(72.9%)。
    公开号:TW201300157A
    申请号:TW100122319
    申请日:2011-06-24
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Chieh-Ming Chang；yi-chen Shen
    申请人:Nat Univ Chung Hsing；
    IPC主号:Y02P20-00
    专利说明:
    從杜莎藻製備高含量β-胡蘿蔔素奈米粉粒體之方法
    本發明涉及一種萃取β-胡蘿蔔素的方法，更詳而言之，是指一種從具有高含量類胡蘿蔔素的杜莎藻中萃取β-胡蘿蔔素的方法。
    大部分微藻當中都富含類胡蘿蔔素，傳統方法萃取微藻中的類胡蘿蔔素常常需要藉由有機溶劑來進行一個以上的萃取步驟，然而這在食品添加過程中是被禁止的。超臨界二氧化碳萃取技術，因具有萃取物無溶劑殘留、能在較低溫度下操作、不會提供多餘的熱能、可降低類胡蘿蔔素氧化裂解現象等優勢，因此適用於β-胡蘿蔔素之產製。
    目前超臨界流體製備微奈米類葫蘿蔔素顆粒技術，如Chang和Randolph於西元1989年以超臨界乙烯與乙烷將β-葫蘿蔔素沉澱產生粉末；Chang et al.於西元1991年利用超臨界二氧化碳自β-葫蘿蔔素混合物中將同分異構物分離；Cocero和Ferrero於西元2002年使用超臨界二氧化碳將乙酸乙酯與二氯甲烷中的β-葫蘿蔔素再結晶；Miguel et al.於西元2006年使用半連續的抗溶沉澱程序將茄紅素從二氯甲烷中沉澱，平均顆粒粒徑為10到80μm。
    關於以超臨界流體萃提類胡蘿蔔素之專利文獻，如中華民國發明公開第201041638號(以下簡稱638案)、第201114466號(以下簡稱466案)。638案係在揭利用共溶劑修飾的超臨界流體萃提微藻的類葫蘿素成份，文獻中探討以預浸式及連續式添加不同比例乙醇共溶劑在超臨界二氧化碳中所得微藻萃取物的結果，乙醇的連續添加比例是影響微藻類胡蘿蔔素萃取效率與濃度的主要變因。466案係利用抗溶結晶技術自索氏二氯甲烷萃取物中獲得含有高濃度之類胡蘿蔔素沈澱物。以超臨界二氧化碳抗溶結晶微藻葉黃素、玉米黃素、β-隱黃質素、α-葫蘿蔔素、β-葫蘿蔔素的實驗結果顯示，當壓力為200bar、絕對溫度為313K、進料溶液濃度為12mg/ml、二氧化碳流速為12 L/min時，能將總類葫蘿蔔素含量由17.56mg/gext提升至23.55mg/gext。
    以上的文獻資料中，提到了提萃類葫蘿蔔素的方法，但該方法未能達到提昇類葫蘿蔔素含量及純度之目的。
    本發明之目的係在利用及改良習知萃提技術之條件及程序，從杜莎藻產製高純度β-胡蘿蔔素奈米顆粒，本發明可從一單位的杜莎藻中回收至少83%的β-胡蘿蔔素，並產製純度至少為72.9%β-胡蘿蔔素的奈米顆粒。
    本發明是以萃取杜莎藻藻粉步驟、管柱層析純化步驟、以及超臨界二氧化碳抗溶再結晶純化步驟三個程序達成上述之目的。萃取杜莎藻藻粉之步驟主要係採取超音波攪拌四氫呋喃(THF)溶劑萃取杜莎藻。管柱層析純化步驟主要係將上一步驟所產出的萃出物加入乙醇作為管柱純化之進料，並以大量乙醇作為沖提液，以設定之沖提流速進行沖提，此一步驟會於層析物上形成一薄層深紅色粉末，將其取出且溶於乙醇-氯仿混合溶劑，再以濾紙過濾之，將層析物濃縮進行冷凍保存形成管柱純化固形物。超臨界二氧化碳抗溶再結晶純化步驟係將定量的管柱純化固形物配製成預定濃度的進料溶液，以設定之條件進行純化，再將所得之沈澱物進行分析。
    將杜莎藻先以特定溶劑進行萃取，同時利用特定沖提液進行層析純化後，使β-胡蘿蔔素固體先具有相當純度，再藉由超臨界二氧化碳抗溶結晶方法，以獲得高純度之β-胡蘿蔔素奈米顆粒，利於商業化大量生產，並可應用於增強免疫、預防癌症、抗氧化及延緩老化的健康產品。
    <<實驗材料>>
    本發明之實驗微藻為杜莎藻(Dunaliella Salina)，由台灣光壁公司所提供。杜莎藻每100公克含有7660毫克的β-胡蘿蔔素，是天然β-胡蘿蔔素的最佳來源。
    <<主要之萃提純化程序>>
    本發明是以萃取杜莎藻藻粉步驟、管柱層析純化步驟、以及超臨界二氧化碳抗溶再結晶純化步驟製得純度至少為72.9%，回收率至少為83%的β-胡蘿蔔素奈米粉粒。
    <<萃取杜莎藻藻粉>>
    以超音波攪拌四氫呋喃(THF)溶劑200毫升萃取杜莎藻藻粉2.5克。溫度條件為303K，萃取時間30分鐘，超音波頻率為40 KHz，功率300 W。
    用4號濾紙(Whatman,USA)過濾，收集濾液，減壓濃縮呈0.6克乾物，可得產率24%的超音波四氫呋喃(THF)萃出物，將之存放於-80℃冰箱中保存至HPLC(High Pressure Liquid Chromatography,高壓液相層析儀)分析。
    <<管柱層析純化>>
    取上述超音波四氫呋喃(THF)萃出物0.3克，加入20毫升乙醇形成過飽和溶液，作為3公分內徑管柱純化之進料，並以2公升95%乙醇作為沖提液，使用定量泵浦沖提，流速控制在40 ml/min。3公分內徑管柱之吸附物為聚苯乙烯吸附劑，在本實驗中，是使用100微米之聚苯乙烯吸附粒子(Polystyrene based adsorbent particles with 100-micron size，簡稱PS100)作為樹脂吸附劑。該吸附劑是一種可再生的反相吸附劑，在適當的使用環境與再生條件下，PS100吸附劑能重複使用，大大減少設備成本與操作時間。
    經過以上層析純化之後，於PS100上方形成一薄層深紅色粉末，將其以刮杓小心取出，溶於體積比為乙醇：氯仿為2:1的混合溶劑中，再以Nylon(0.45μm)濾紙過濾之，且以HPLC分析後減壓濃縮至26.4毫克，可得β-胡蘿蔔素純度36%以上的管柱純化固形物，且回收率達到35.9%。
    <<超臨界二氧化碳抗溶再結晶純化>>
    將定量22.2毫克的管柱純化固形物，溶於7.4毫升四氫呋喃(THF)定體積溶液，配製成3mg/ml濃度進料溶液，在超臨界二氧化碳抗溶結晶裝置進行純化，其設定條件為：溶液進料時間為35 min，溶液進料流速為0.2 ml/min，溶液進料濃度為3 mg/mL，抗溶結晶壓力設為150 bar，二氧化碳流速為27 g/min。純化後可得沉澱物產率為41%，其中β-胡蘿蔔素純度為728.5mg/g(72.9%)，且回收率為83%。
    超臨界二氧化碳抗溶再結晶純化是由第一圖所示之超臨界二氧化碳抗溶結晶裝置執行。其運作程序大致如下：
    一、將二氧化碳液體從鋼瓶1內的虹吸管壓出，並外接循環水槽4降至4℃後，經由二氧化碳幫浦增壓模組3，將液態二氧化碳輸送至預熱槽5-1中，預熱成超臨界二氧化碳，預熱溫度由溫度控制箱10控制。
    二、藉由觀測壓力錶2-1與2-2的壓力數值，調整背壓閥6-1與6-2承受的壓力，將沉澱槽8內壓力與溫度調整並控制到上述實驗條件，再調整二氧化碳增壓模組3輸送二氧化碳的幫浦衝程頻率，調控結晶槽下方閥門開度，並記錄濕式流量計的累積流量，以達到控制二氧化碳流速的目的。
    三、等到實驗溫度、壓力、流速穩定後，將量筒13內進料溶液經由過濾管12進入HPLC幫浦11內，輸送至沉澱槽8中進行抗溶結晶。槽底部開口處連接一個1/4”轉1/2”的管件，在內部放置1張約1公分外徑的PTFE濾紙(0.1 μm)及2張不鏽鋼網(37μm)支撐濾紙，以收集沉澱顆粒。
    四、進料溶液溶液進入後，再泵入1.5毫升四氫呋喃(THF)溶液並將管內剩餘進料溶液(約1.5毫升)推進沉澱槽內。
    五、待抗溶時間到達35分鐘後，關掉HPLC幫浦11，但持續輸送等溫等壓的超臨界二氧化碳，用以去除及乾燥沉澱槽內殘餘溶劑，每次抗溶結晶，均使用200升的二氧化碳乾燥之。
    六、最後，調整背壓閥6-2，將槽內壓力洩至常壓並開過濾器，取出濾紙，秤量濾紙上沉澱物的重量，並取定量溶於20毫升體積比為乙醇與氯仿的混合溶劑中，以HPLC測定沉澱物中β-胡蘿蔔素濃度。
    七、槽內附著在管內壁的沉澱物，以HPLC幫浦(11)，輸送90毫升的四氫呋喃(THF)進入結晶槽內清洗，將洗出液減壓濃縮後稱重，與濾紙上沉澱物合併，以計算總產率。
    <<結果>>
    本發明將杜莎藻藻粉經超音波四氫呋喃(THF)溶劑萃取，經3公分管柱純化後，再以超臨界二氧化碳抗溶四氫呋喃(THF)溶液獲得結晶沉澱。3公分內徑管柱層析純化方法，可得到固形物含36%純度的β-胡蘿蔔素且回收率為35.9%。再經超臨界二氧化碳抗溶結晶沉澱之後，β-胡蘿蔔素的純度可達728.5 mg/g(72.9%)。
    本發明將杜莎藻乾燥藻粉經超音波四氫呋喃(THF)溶劑萃取，經管柱純化後，可得到純度36%以及回收率35.9%以上的β-胡蘿蔔素固形物。在超臨界二氧化碳抗溶再結晶沉澱之後，回收83%β-胡蘿蔔素，可得β-胡蘿蔔素奈米顆粒，其純度可達728.5 mg/g(72.9%)。
    1．．．鋼瓶
    2-1．．．壓力錶
    2-2．．．壓力錶
    3．．．二氧化碳幫浦增壓模組
    4．．．循環水槽
    5-1．．．預熱槽
    6-1．．．背壓閥
    6-2．．．背壓閥
    8．．．沈澱槽
    10．．．溫度控制箱
    11．．．HPLC幫浦
    12．．．過濾管
    13．．．量筒
    第一圖本發明超臨界二氧化碳抗溶結晶裝置之示意圖。
    1．．．鋼瓶
    2-1．．．壓力錶
    2-2．．．壓力錶
    3．．．二氧化碳幫浦增壓模組
    4．．．循環水槽
    5-1．．．預熱槽
    6-1．．．背壓閥
    6-2．．．背壓閥
    8．．．沈澱槽
    10．．．溫度控制箱
    11．．．HPLC幫浦
    12．．．過濾管
    13．．．量筒
    权利要求:
    Claims (8)
    [1] 一種從杜莎藻製備高含量β-胡蘿蔔素奈米粉粒體之方法，包含以下步驟：(a)以超音波攪拌四氫呋喃(THF)溶劑毫升萃取杜莎藻藻粉並進行濃縮，以獲得超音波四氫呋喃(THF)萃出物；(b)將步驟(a)之萃出物溶解於乙醇中製得管柱純化之進料溶液，再利用樹脂吸附管柱以及乙醇沖提程序進行層析純化，再經濃縮程序而獲得純度為36%以上、回收率為35.9%的管柱純化固形物；(c)將步驟(b)之管柱純化固形物溶解於四氫呋喃(THF)溶液，製得一進料溶液；(d)利用超臨界二氧化碳抗溶結晶純化程序，使該進料溶液進行純化，以獲得純度為72.9%以上、回收率為83%以上的β-胡蘿蔔素奈米粉粒體。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟(a)之溫度條件為303K，萃取時間30分鐘，超音波頻率為40 KHz，功率300 W。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟(b)係使用100微米之聚苯乙稀吸附粒子作為管柱純化之填充吸附劑。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟(b)管柱純化之進料溶液係為四氫呋喃(THF)萃出物與乙醇混合所形成之過飽和溶液。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟(b)之沖提液為95%乙醇。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該步驟(b)之沖提液的沖提流速控在於40 ml/min。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟(c)之進料溶液濃度為3mg/ml。
    [8] 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該超臨界二氧化碳抗溶結晶純化程序之設定條件包括：溶液進料時間為35 min，溶液進料流速為0.2 ml/min，抗溶結晶壓力設為150 bar，二氧化碳流速為27 g/min。
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